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胰酶使用注意及貼壁細胞的消化

更新時間:2023-02-06      點擊次數(shù):1756

胰酶使用注意:


1、在使用胰酶細胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細菌污染。


2、胰酶細胞消化液消化細胞時間不宜過長,否則細胞鋪板后生長狀況會較差。


貼壁細胞的消化:


1、吸去培養(yǎng)液,用無菌的PBS、Hanks液或無血清培養(yǎng)液洗滌細胞一次,以去除殘余的血清


2、加入少量胰酶細胞消化液,略蓋過細胞即可,根據(jù)胰酶效率差異可以增加惑減少胰酶用量。室溫放置30秒至2分鐘(不同的細胞消化時間有所不同)


3、顯微鏡下觀察,細胞明顯收縮,并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化呈白茫狀;或者用槍吹打細胞發(fā)現(xiàn)細胞剛好可以被吹打下來。


4、此時吸除胰酶細胞消化液。加入含血清的細胞培養(yǎng)液,吹打下細胞,即可直接用于后續(xù)實驗如果發(fā)現(xiàn)消化不足,則加入胰酶細胞消化液重新消化。


如果發(fā)現(xiàn)細胞消化時間過長,未及吹打細胞,細胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落,直接用胰酶細胞培養(yǎng)液把細胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘,沉淀細胞,盡量去除胰酶細胞消化液后,加入含血清的培養(yǎng)液重新懸浮細胞,即可用于后續(xù)實驗。


常用的細胞消化液為胰蛋白酶(Trypsin),EDTA等,其功能主要是使細胞間的蛋白質(zhì)(如細胞外基質(zhì))水解,改變細胞間的連接,使組織或細胞片分散成單個細胞,制成細胞懸液用于進一步的實驗。


影響消化速度的因素較多,主要有胰酶溶液的活性(配制條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復凍融、化凍后存放時間及溫度等)、消化時的溫度(氣溫、細胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等 。


加入胰蛋白酶-EDTA溶液,視細胞瓶的大小加入體積為2ml或更多(依培養(yǎng)器皿的大小而定),以使充分浸潤;


一般消化時間約為1至3分鐘,肉眼觀察瓶底由半透明(細胞單層連接成片)轉(zhuǎn)為透明、點狀(出現(xiàn)細小空隙)時,棄去細胞消化液,或看見培養(yǎng)瓶壁呈白茫狀即可。并加入適量的培養(yǎng)液終止消化,吹打分散;如見大量細胞片狀脫落,已消化過頭,則不能頃倒消化液而直接進行下一步操作。(消化過頭,可造成大量細胞從瓶壁上脫下,甚至造成細胞破碎。由于血清含有非特異性胰蛋白酶抑制劑,所以加入培養(yǎng)基可以終止反應。


胰酶配置方法:


1、培養(yǎng)液配制,方便好用,對細胞影響小,并且培養(yǎng)液的ph值正好適合胰蛋白酶的溶解


2、生理鹽水配制,要先調(diào)ph值7.2到7.4(①胰酶(1:250) 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力攪拌2-3小時,調(diào)pH 7.8-8.0,過濾除菌。)


3、pbs(0.1%胰酶溶液的配制:稱取胰酶粉末0.1g,先用少許滅菌過的PBS調(diào)成糊狀,然后補足到100ml。置室溫攪拌4小時或冰箱內(nèi)過夜,過濾滅菌,分裝,4℃保存?zhèn)溆谩#? 或是hanks或是D-hanks液配制(1.稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中,先用少許D-Hanks 平衡鹽溶液(pH7.2 左右)調(diào)成糊狀,然后再補足D-Hanks 平衡鹽溶液,攪拌混勻,置室溫4 小時或冰箱過夜,并不斷攪拌振蕩;2.次日,先用濾紙粗濾,再進行過濾除菌,分裝入瓶中,低溫冰箱保存?zhèn)溆茫S脻舛葹?.25% 或0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸,使用前可調(diào)用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 至7.2 左右。)


一般0.45微米的一次性濾器過濾除菌,至于作用效果,需要消化一次細胞感覺一下,因為不同廠家的酶不一樣,有的作用溫和,有的作用劇烈。


4、是否需要四度放置過夜,取決于你的胰酶的純度。過去的胰酶純度不高,所以難以溶解,需要四度過夜. 而現(xiàn)在的胰酶純度都很高,就沒有必要四度過夜。從理論上來說,四度放置過夜,給細菌生長的機會,盡管過濾可以出去細菌,可是出不掉其代謝產(chǎn)物。


胰蛋白酶不溶,有絮狀物的原因,考慮有:


1、過期或是酶已經(jīng)部分變性


2、溶液ph值不對


3、在沒過濾之前的絮狀沉淀是正常現(xiàn)象,因胰酶多取自動物胰腺,沉淀為組織塊,過濾后即可


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